一、症狀
HSV感染是一種全身性疾病，病毒經呼吸道、口腔、生殖器粘膜或破損皮膚進入人體，可潛于人體正常粘膜、血液、唾液以及局部感覺神經節和多數器官內，幾乎所有的內臟和粘膜表皮內都可分離到HSV。
原發感染多為隱性，大多無臨床症狀或呈亞臨床表現，僅有少數(約1-10%)可以出現臨床症狀。主要見於免疫功能低下嬰幼兒或嚴重營養不良或有其它感染的兒童，成人罕見。原發感染消退後，病毒可持續潛居體內。正常人中約有半數以上為本病毒的攜帶者，可通過口、鼻分泌物而成為傳染源，由於HSV在人體中不產生永久免疫力，故每當機體抗病能力減退時，如患某種發熱性傳染病，胃腸功能紊亂、月經、妊娠、病灶感染、過度疲勞、情緒環境改變時，體內潛伏的HSV即被激發而發病。
HSV-1主要引起口唇皰疹，咽炎，角膜結膜炎和散發性腦炎，而HSV-2感染主要引起生殖器皰疹，但在臨床上也有相反情況。
HSV感染的潛伏期為1-45天，平均為6天，HSV-1感染主要發生於口角、唇緣、鼻孔等皮膚粘膜交界處，亦可見顏面或口唇，開始局部先有灼癢及輕度緊張感，偶有伴發神經痛。隨即出現紅斑，在紅斑基礎上發生簇集性小丘疹，迅速變為粟粒至綠豆大小的水皰，內容澄清，水皰破裂後出現糜爛面，數日後乾燥結痂。自覺灼癢，偶有倦怠，不適和輕微發熱等全身症狀，癒合可遺留暫時性色素沉著。全病程1-2周左右。
HSV-2感染主要發生於生殖器部位，患部先有燒灼感，很快在紅斑的基礎上發生成群的小水皰，多見男性包皮、龜頭、冠狀溝、陰莖等處，偶見於尿道；女性常見於陰唇、陰蒂、陰道、宮頸等處。水皰可逐漸變成膿皰，約6天左右破潰而形成糜爛或淺的潰瘍，自覺疼痛。病人可發生尿道炎，出現排尿困難。多數人有腹股溝淋巴結腫大疼痛，有的病人可出現發熱、肌肉痛及腦膜炎症狀。如發于女性宮頸者可形成潰瘍壞死，陰道分泌物增多，可有下腹痛。應注意有無宮頸癌發生。孕期患生殖器皰疹時易致流產、早產或死胎，並易使新生兒感染，發生新生兒單純皰疹。本病一般經過3周左右可以痊癒，但常有反復發作，一般原發疹後1-4個月內復發，症狀較原發者輕，範圍亦小，局限於生殖器部位，有時僅有1-2個皰疹，病程亦短，自發病至癒合8-12天。本病也可伴有生殖器以外部位的感染，如口唇、臂部及中樞神經系統等。
二、體征
皮損為紅斑基礎上可見成群的水皰或膿皰或成糜爛及潰瘍。女性患者約90%伴有HSV宮頸炎，宮頸可見發紅、糜爛、潰瘍，有膿性陰道分泌物。有的患者可有腹股溝淋巴結腫大壓痛或體溫升高。皮膚病變也可出現在口唇 、手指、臀部、大腿、手臂，甚至眼部與咽喉。併發腦膜炎或橫貫性脊髓炎，一般於發疹後3-12天出現頸項強直等顱內壓增高的現象。
三、潛伏感染和復發
HSV感染人體後1周左右，血中出現中和抗體，3-4周達高峰，可持續多年，這些抗體能清除病毒和使機體康復，但大多數個體不能徹底消滅病毒，也不能阻止復發，病毒以潛伏狀態長期存在宿主體內。不同亞型HSV感染者急性首發生殖器皰疹的臨床過程相似，但生殖器病變復發率不同，首發HSV-2感染者約90%，在12個月內會出現一次復發(平均復發4次)，而初次感染HSV-1者僅50%出現類似復發(平均復發次數小於1)。不同個體及同一病人一生中生殖器HSV-2感染的復發率變化很大，大多數年復發5-9次，一般在原發皰疹消退後1-4個月內發生，有些患者受到促發因素，如發熱、月經、日曬、寒冷、某些病毒感染等的影響而復發，其特點是每次復發往往發生在同一部位，復發前可有前驅症狀如局部瘙癢，發疹前數小時感染部位有灼燒，麻刺感。
復發生殖器皰疹(GH)對患者心理影響較大，由於目前尚無預防復發的有效療法及可能有誘發生殖器惡變的危險性，故給患者帶來心理影響，患者多有抑鬱、恐懼等心理障礙，這又直接影響HSV的復發。我們的治療經驗，只要患者堅持規律治療，都能治癒。
四、HSV與HIV感染：
HSV常與HIV-1同時感染，並能促進病情發展，引起嚴重的局部和播散性感染。目前認為HSV是一種調節因素，能啟動HIV複製，Heng對6例AIDS合併生殖系統HSV皮膚損害患者進行皮膚活檢，發現角化細胞和巨噬細胞均有HIV-1和HSV-1雜交後使HIV-1保留其感染性，而無需與CD4分子結合即能進入細胞內。此外HSV-1能刺激潛伏型HIV-1，而增加HIV-1/HSV-1共同感染和在組織中的複製。
表皮細胞發生氣球樣變性，其中可見有嗜酸性包涵體。表皮開始為網狀變性形成的多房性水皰，以後聚合為單房性水皰。真皮乳頭層有輕度水腫，有輕重不等炎性細胞浸潤。反應嚴重時可有嚴重血管炎表現。
HSV感染的診斷要依據病史、臨床表現和實驗室檢查結果而定。有不潔性交史，而且在生殖器部位出現皮膚紅斑和原發性水皰，易復發等不難診斷。必要時可作皰液塗片，培養、接種、免疫螢光檢查。血清免疫抗體測定等，均有助於診斷和確定病毒類型。
一、細胞學方法
對皮損刮片做Wright-Gemsa (Tzanck試驗)或Papanicolaou染色，可檢出HSV感染特徵的巨細胞包函體，但不能區別HSV感染或水痘 — 帶狀皰疹病毒感染，敏感性僅為病毒分離的60%。
二、培養法
從水皰底部取材做組織培養分離病毒，為目前較敏感、最特異的檢查方法，需5-10天，因其技術條件要求高，價格昂貴，不能普遍使用。
三、抗體檢測
目前最廣泛的是HSV-2抗體檢測，如蛋白印跡法也可用gD2作抗原檢測HSV-2抗體，具有敏感性，且能區分HSV-1和HSV-2的優點
四、基因診斷
(一)用PCR分型檢測單純皰疹病毒
PCR是一種敏感性高，特異性強的快速檢測方法，標本中含有1fg HSV-DNA就可以檢出，其在HSV感染的診斷研究中發展較快，且分型檢測HSV是發展的趨勢。
1、標本採集和處理
(1)標本採集
①腦脊液：直接無菌採取患者0.5ml腦脊液標本於無菌試管送檢.如肉眼可見血色，應離心取上清。
②羊水及嬰兒血清: 同上，應避免溶血.
③腦組織: 腦組織屍檢、活檢標本， 加1ml PBS標本緩衝液研磨後，待檢。
④眼及皮膚病灶分泌物：用預測(半幹)棉拭子直接取患處分泌物， 置1ml PBS標本緩衝液中送檢。
⑤生殖器(宮頸、陰道、外陰、陰莖)標本：先用消毒棉拭子擦去病變部位表面粘液、污垢，再用預潮棉拭子用力擦拭患處分泌物，置1ml PBS標本緩衝液中送檢。
(2)標本處理
①預處理：所有液體標本均可直接進行範本製備；可以取100μl標本液，離心5000 r/ min×5min後，去上清，取沉澱物進行範本製備。
②範本製備：a: 蛋白酶K消化裂解法：沉澱物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1 h後，煮沸10 min，離心5000 r/ min×5min，收集上清。 b: 水煮法：沉澱物加100μl蒸餾水，搖均水煮20 min，離心5000 r/ min×5min收集上清。c: 1%Triton X-100裂解法:取採集的標本液100μl，加入1μl Triton X-100，水煮20 min，5000 r/ min×5min，收集上清。d: 5%NP-40裂解法：取採集的標本液100μl，加5μl NP-40，水煮20 min ，5000 r/ min×5min收集上清。e: 如標本溶血嚴重經上述裂解處理後，再加等體積酚-氯仿抽提、冷乙醇沉澱DNA，加10μl DW溶解待檢。
2、PCR擴增
(1)引物設計。以HSV DNA聚合酶的高保守區為檢測靶序列以確保特異性。設計3個引物，一個上游共同性引物，DNAP5(5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′)：二個下游特異性引物，DNAP3-1(5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′ )和DNAP3-2(5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′)，可以分別擴增出HSV-1 469bp DNA片段(1981～2359)、HSV-2 391bp片段(1561～1953)：從二型PCR擴增產物中設計了一個不分型的特異性探針HSVP3 5 ‘GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG 3‘)。
(2)PCR實驗體系。取範本10μl： DNAP5 0.5(0.2μmol/L)：DNAP3-1 0.5μl (0.2μmol/L)：DNAP3-2 0.5μl (0.2μmol/L)：4×dNTP 8μl(4×200μmol/L)：10×dNTP 8μl(4×200μmol/L)；10×緩衝液10μl：DMSO 4μl；加DW 65.5μl； 石蠟油 30μl.。
水煮(96℃～100℃)7min
加TaqDNA聚合酶1μl；(2.5U)
72℃4 min
↓
95℃40s
↓
65℃60s → 72℃70s
↓ 33個迴圈
70℃4 min
3.擴增產物的檢測和分析
(1)瓊脂糖凝膠電泳染色法：取擴增產物20μl加樣品緩衝液4μl混勻後，點樣於2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15～20min，溴化乙錠(EB)染色5min，於紫外燈下觀察結果在溴酚藍後面有一條或二條亮紅帶為陽性結果，HSV-2帶在前，HSV-1帶在後，無帶則為陰性結果。
(2)XhoI酶譜法：取HSV-1型PCR產物50μl加XhoI50U，37℃1h後，置3%瓊脂糖凝膠中，70V電泳15～20min，可產生46bp片段帶(引物後面)；與正常PCR產物比較，XhoI酶切後的大片段電泳位置前移。
(3)Southern印跡法：PCR產物20μl經電泳分離後，用變性液處理60min，再用中和液處理90 min，轉移至硝酸纖維素膜上：80℃烤膜2 h，42℃預雜交(雜交液中)30 min， 加入32p標記HSVP3探針後，42℃雜交過夜；次日用1%SDS/ PBS pH7.2， 42℃洗15min， 0.5% SDS/PBS pH7.2， 42℃洗15min； 膜置X線暗盒內放射性自顯影12～15h， 顯影為陽性， 不顯影為陰性。
(二)模式PCR
模式PCR(nested primers-polymerase chain reaction，NP-PCR)是通過“外側”、“內側”兩對引物，即一對擴增較大DNA片段的“外側”引物和一對位於擴增產物中再擴增小片段的“內側”引物，這樣兩次連續放大可以提高PCR檢測的靈敏度，保證產物的特異性。但該方法不能分型，能100%檢出HSV-1，50%檢出HSV-2，應改進分型檢測HSV，更好地在臨床應用和基礎研究中推廣應用。
1、標本處理：
(1)標本採集同上
(2)DNA 製備：①腦脊液：取100μlCSF 水煮15min，加入250μl無水乙醇，放-30℃10 min；離心10000g30 min，去上清，30℃乾燥後，加入10μl DW； ②腦組織細胞：取沉澱物加100μl蛋白酶K消化裂解液，56℃作用1h，水煮10 min；取上清加入等體積酚一氯仿(V/V)，輕搖10 min，離心10000r/ min×10 min；取水相，加入250μl DW溶解。
2、PCR擴增
(1)引物設計：選擇HSV1糖蛋白D基因為檢測靶基因。
NP-PCR 的引物和探針序列
“外”引物
BJHSV1.1ATCACGGTAGCCCGGCCGTGTGACA19-43
BJHGV1.2CATACCGGAACGCACCACACAA218-239
“內引物”
BJHSV1.3CCATACCGACCACACCGACGA51-79
BJHSV1.4CGTAGTTGGTCGTTCGCGCTGAA166-188
探針
BJHSV-1PROTACGAGGAGGAGCTGTATAACAAAGTCTGT96-125
(2) PCR實驗體系和程式: 反應體積為50μl；範本10μl；BJHSV1.1 0.5μl(0.2pmol/L)； BJHSV1.2 0.5μl(0.2pmol/L)； 10×緩衝液5μl； 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L)；DW 27μl； 石蠟油30μl。迴圈參數為95℃30s； 55℃30s； 72℃60s； 迴圈20次， 取其擴增產物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反應體系中進行模式擴增， 先95℃變性2min，迴圈參數為95℃30s； 55℃30s； 72℃60s； 迴圈30次後，72℃延伸5 min；。
(3) 擴增產物分析：
① 瓊脂糖凝膠電泳染色法：
取擴增產物10μl點樣於2%瓊脂糖凝膠中， 70V電泳15-20min，溴化乙錠染色5min，於紫外燈下觀察結果，在溴酚蘭後面有一條，或二條亮紅條帶為陽性結果， HSV-2帶在前，HSV-1帶在後，無帶則為陰性結果。
② Southern印跡法：
PCR產物20μl 經電泳分離後，用變性液處理60min，再用中和液處理90min，轉移至硝酸纖維素膜上，80℃烤膜2h，42℃預雜交(雜交液中)30min，加入32P標記HSV探針後，42℃雜交過夜，次日用1%SDS/PBS pH7。2，42℃洗15min，0.5%SDS/PBS pH7.2，42℃洗15min；膜置X線暗盒內，放射性自顯影12-15h，，顯影為陽性，不顯影為陰性。
(三)、聚合酶鏈反應—酶譜法(polymerase chain reaction-endonuclease cleavage PCR-EC)
具有經濟廣泛等特點；不僅能一次性分型檢測HSV-1，HSV-2，EBV，CMV四種病毒，而且方法本身快速、方便、無放射線損傷，易被實驗室接受。可檢出3個CFU的HSV1，靈敏度高，能檢測出中樞神經系統感染第1dCSF中HSV DNA陽性結果，並可用於藥物治療效果的評價。由於病毒的變異性，會出現酶切點突變丟失現象，從而造成酶切陰性結果。對此可以通過型特異性探針或序列分析解決
1. 標本處理
(1)標本採集，方法同上。
(2)DNA範本製備：每份標本取200μl，按200μg/ml加入蛋白酶k，56℃作用1h；
加入等體積的酚—氯仿(v/v)輕搖10min，離心1000r/min×5min；取水相加入500μl(2.5倍體積)無水乙醇，-20℃過夜沉澱DNA，離心15000r/min×5min，吸去液體，30℃乾燥後，加蒸餾水25μl溶解， 待檢。
2. 引物設計：
P1，5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′
P2，5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′
(1)PCR實驗體系：
反應體積100μl； 範本10μl ； P1 0.5μl(10pmol/L) ，P2 0.5μl(10pmol/L)； 4×dNTP 4μl(4×200mmol/L)； 10×緩衝液10μl， DMSD 5μl， DW 65μl， 迴圈參數為94℃60s； 60℃60s； 72℃60s；迴圈40次72℃延伸4min。
(2)擴增產物檢測與酶切分型.
①第一步電泳鑒定: 取10μlPCR產物加4μl樣品緩衝液，加入2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳(5-20min)加EB染色5min後，紫外燈下觀察，可初步鑒定擴增產物大小。
②酶切分析：分別取20μlPCR產物於2個Eppendorf管中，加入50μl無水乙醇，-20℃沉澱DNA，再分別用20μlSmal和BamHI反應緩衝液溶解，加入SmaI或BamHI 50U于相應Eppendorf 管內，37℃作用1h。
③第二步電泳分型，取10μlPCR酶切物加4μl樣品緩衝液，加到2%瓊脂糖凝膠中，70V電泳，15-20min後， EB染色5min，與同步加入未酶切的PCR產物相對照。 紫外燈下觀察， 結果如下:
PCR-EC法檢測四種病毒結果
病毒型號靶片段SmaIBamHI
HSV1518bp476bp+42bp
HSV2518bp—225+293bp
EBV524bp100bp+424bp277bp+247bp
CMV589bp不需酶切，第一步電泳就可以區分
(四)用RT-PCR檢測單純皰疹病毒
RNA的聚合酶鏈反應(RNA-PCR)，可能通過檢測HSV不同期的RNA，這不僅可診斷HSV感染，而且有利於HSV的潛伏期感染機制的深入研究。
RT-PCR是以RNA為範本經逆轉錄反應(RT)產生cDNA，再以cDNA為範本進行PCR擴增以達到檢測目的。因此，RNA-PCR也可稱為RT-PCR。
1、標本處理：
組織塊細胞總RNA提取，取100mg組織標本，加1ml硫氰酸胍變性液，於勻漿器中，室溫研磨均勻後，移入2.5mlEppendorf 管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc， 1ml水飽和酚和0.2ml氯仿一異戊醇混勻， 用力振搖10s， 置冰浴15min。10000g4℃，離心20min，取上清水相(上層DNA、下層DNA和變性蛋白質)加入等體積異丙醇置-20℃1h， 沉澱RNA。離心 15000r/min×10min，棄上清， RNA重新用0.3ml硫氰酸胍變性液溶解， 再加0.3ml異丙醇沉澱， -20℃1h， 沉澱RNA. 離心15000r/min×10min， 去上清， 沉澱RNA用75%冷乙醇洗一次， 真空乾燥。.加10μl TE緩衝液(pH7.4)溶解，低溫保存備用.臨用前冰浴溶解。
2、PCR擴增:
(1)引物設計: 選擇HSV-1ICPO基因(極早期)為檢測靶基因.設計2個引物，
P1 5′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT 3′
P2 5′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG 3′可以擴增ICPO 中266bp序列。
1個探針：5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。
(2)PCR實驗體系： 總反應體積為50μl，範本10μl (0.25-1.0μg)P1 1μl (20pmol/L)；P2 1μl (20pmol/L)； 4×dNTP 4μl(200μmol/L)； 10×緩衝液5μl； AMV(逆轉錄酶) 2μl (50U)； DW 26μl； 迴圈參數， 94℃變性2min後 94℃50s，60℃60， 72℃60s，迴圈40次後72℃延伸5min。
3、擴增產物的鑒定：
(1)瓊脂糖凝膠電泳染色法：取10μl PCR擴增產物加4μl 樣品緩衝液，混勻後加樣2%瓊脂糖凝膠板，70V電泳15-20min，EB染色5min。紫外燈下觀察擴增條帶。
(2)Southern印跡雜交法：用32P標記的特異性探針檢測PCR產物，方法同上。
總之，在HSV感染性疾病的臨床診斷中，PCR能對前病毒或潛伏期低複製的HSV特異性靶DNA片段進行擴增檢測，遠較DNA探針敏感，並能在血清中抗體出現前就可以檢出。因此，PCR無論是作為基礎研究手段，還是作為臨床檢驗診斷方法，均具有廣闊的前景。 五、病理組織學診斷
細胞內水腫，基底層形成大水皰，病灶周圍有多核巨細胞浸潤，特別是多核白細胞與淋巴細胞充斥於病灶中間。
本站文章部分收集來源網路、作者及網友推薦、收集、整理而來，僅供學習和研究使用。如有侵犯您的版權，請及時聯繫我們，我們將在最短的時間內給予更正。僅供參考